【技术盘点】流式江湖之“七种武器”

　　《七种武器》是古龙的中篇系列武侠小说 ，七种武器各具特色。长生剑、霸王枪、碧玉刀、多情环、离别钩、孔雀翎、箱子（英雄无泪），件件精妙绝伦，在一个个大侠的手里耍得出神入化。而梳理流式江湖的技术流派，也恰好有七种方向。所以笔者今天就附会一下古大师的名篇，总结一下流式江湖的“七种武器”。

　　序言：流式技术的核心是鞘流包裹样本流，颗粒在样本流中单个排列经过激光照射产生光信号。所谓“流式”也是因流体聚焦技术而得名，检验测试过程如下图所示。

　　古龙的七种武器开篇即为“长生剑”。大概因为剑是江湖上最常见、最经典的一种武器，号称“百兵之君”。而利用“鞘流”技术进行细胞分析，也是流式技术的最经典的应用。

　　具体产品品种类型包括血液分析仪（血球仪）、流式细胞仪；二者都是利用鞘流技术使得血细胞（红细胞、白细胞、血小板等）单个排列，经过激光激发产生各种光信号，然后经过光电检测技术、电子技术、软件算法等分析识别，输出细胞计数及分群分类的结果。

　　1）血球仪：目前市场上的主流血球仪都实现了样本的前处理自动化、信号分析识别算法自动化、检测结果报告输出自动化，形成“端到端”的一键解决方案，是流式技术最成熟的应用领域。

　　2）流式细胞仪：区别于血球仪的特定应用定位，其主要作为通用的研究平台而存在，可以研究生物、医疗、环境、海洋、餐饮、制药等各种领域的各种颗粒型对象，具体如细胞、细菌、真菌、藻类等。主流的流式细胞仪构造只包括：流式检测功能、原始数据输出、人机交互展示功能（测量参数设置、输出散点图、直方图等）等。并没有血球仪的前处理自动化、分析识别自动化、报告输出傻瓜化，

　　液相芯片技术是流式仪器技术与试剂微球技术相结合而产生的。其特点是利用颜色编码微球包覆抗体或者核酸探针，在液相反应体系中利用免疫学反应及分子杂交，实现蛋白分析与核酸检验测试。在免疫诊断场景中，通过免疫学抗原抗体特异性结合，使微球、蛋白、检测抗体形成“三明治夹心”结构，实现多重检测。

　　化学发光技术一次只能检测一个指标，而液相芯片技术理论上可以同时检测超过500个指标。并且将流式技术进一步扩展到分子诊断领域，所以液相芯片技术在检验测试对象角度从细胞分析扩展到蛋白检测和核酸检验测试。从检验测试手段角度，将化学发光的单指标检测，扩展到多指标联检。这一技术符合国内体外诊断的发展的新趋势，能够大大减少患者等待时间，减少检验人员工作量，减少试剂用量，降低检测成本。

　　而试剂技术包括编码微球技术、抗原抗体开发、核酸探针设计等多方面，涉及材料学、化学、生物学等多个学科，而且触及比较基础的研究领域；由于其样本处理过程套路固定、输出指标分析是固定范式（跟发光免疫相同），所以与目前IVD主流手段化学发光相对照，其发展的新趋势必然是前处理自动化、检测分析自动化、报告输出傻瓜化。从而类似在细胞分析领域演化形成血球仪，免疫和分子诊断领域也可以演化出各种常规检验测试设备。只不过由于微球稳定性、试剂交叉干扰、材料发光效率及仪器成本及稳定性等各方面的原因，这需要各领域各专业的持续努力才能真正落地。

　　当我们有机会去除流式细胞仪的这个邪恶的Bug时，为什么我们还需要花费这么多时间和精力专注于补偿呢？一个又一个教程，一篇又一篇Paper，一个又一个问题。痛苦难道是流式细胞术的必要组成部分吗？”—《Spectral flow cytometry—Quo vadimus?》 By J. Paul Robinson of Purdue University。

　　由简单的信号强度分析扩展到光谱特征分析。该技术能够大大降低试剂选择、试验方案、荧光补偿等过程的复杂度，令使用者更加从容的进行流式检测。代表了流式仪器技术发展进入了一个新的时代；

　　光谱流式的技术特征如上两图所示，其在检测光路和后期算法处理上做了革命性的创新，将传统的荧光强度分光系统变成了光谱特征（包含强度同时分析光谱形状）分光系统。市场上的一种光谱流式仪器的设计方式将“树杈形”分光系统变成了“弯刀形”的色散分光系统。“碧玉刀”由此附会成功（^_^），而其高昂的仪器价格也与“碧玉”二字相契合。

　　从来不用刀——《醉拳》在古龙的《七种武器》中，《碧玉刀》与《多情环》如双峰并立，正如流式江湖中光谱流式与质谱流式的交相辉映。《碧玉刀》风格从容优雅、闲适自如，正如光谱流式的检测光谱如雨后彩虹、宁静从容。《多情环》风格暴风骤雨、泣鬼惊风，正如质谱流式的检测模块ICP（电感耦合等离子体——“多情环”是也）令检测颗粒灰飞烟灭、化为乌有。

　　。最后通过专业的数据分析软件做处理分析，最终达到对细胞表型进行精细观测的目的。过程如下图所示：

　　第一、标签系统的不同，前者主要使用各种荧光基团作为抗体的标签，后者则使用各种金属元素作为标签；第二、检测系统的不同，前者使用激光器和光电管作为检验测试手段，而后者使用ICP质谱技术作为检验测试手段。别的方面如抗原抗体结合、流体聚焦技术、检测结果的散点图展示等是相同的。也正因为依然使用流体聚焦技术，所以其依然称为“流式”。

　　纳米流式也将检验测试对象推向更小的尺度，从常规0.2-100微米级减小到几十纳米。

　　电荷分选方式如下图所示，采取从上往下流向，通过流体压力（几百kPa）、超声振荡（几十到几百kHz）、喷嘴设计（几十至几百um）等环节，将流出的液流打散成断裂的一个个小液滴。在小液滴断裂前，给其施加正负电荷，然后在高压静电（几千伏）偏转板的作用下，左偏或右偏被分选到特定样本管中。

　　机械分选：采取机械力的方式干预样本流，改变其流动方向从而进入不同的容器，实现分选。常见的方式有在普通流动室的出口处增加一个可以高速动作的机械件干预样本流流动方向，进入不同的出口管路中实现分选。随着微流控技术的发展，更多的是采取在微流控芯片上通过设计“微泵”、“微阀”等实现液流的干预，以此来实现分选功能。

　　流式细胞仪像大部分检测技术一样，自诞生起首先作为科研仪器使用，为生物学医学研究人员服务，然后慢慢演化成临床诊断设备。“科研仪器”与“诊断设备”具有各自不同的使用场景。前者的特点是操作者多为科研人员，具有科学素养和研究分析能力，可以设计各种实验方案、配制各种样本，然后在仪器上测量分析得出结论，甚至将数据整理发表成文章。后者的特点是操作者科学素养一般，分析能力较弱，不喜欢手工配制样本及各种参数设置，因害怕操作失误导致诊断结果谬误。他们期望的是一键操作、自动报告，自动化、标准化、一致性、可靠性。

　　浪君五六年前在迈瑞工作时，也曾经设计开发了一款全自动流式样机（公司战略原因没有产品化）。然而由于仪器成本、尺寸、可靠性（与发光仪等方式相比，俗语说“就怕货比货”），微球质量、洗涤难度、生化稳定性及特异性等原因，导致这个梦想依然没有完全实现。

　　流式技术在体外诊断市场中仍然处于早期混沌状态，而在科研和工业领域更是有很多可能性需要去探索和发现。这种未知感和可能性是令人憧憬的！回首过去几十年，在行业先辈的努力下，流式技术从无到有、开枝散叶，取得了异彩纷呈的丰硕成果；展望未来，迷茫的人会说“已经没啥可做的了”，但浪君认为：一切才起步……

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